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Cell Counting Kit-8 (CCK-8)
Catalog No. K1018
用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性試驗(yàn)
Description
我們的產(chǎn)品Cell Counting Kit-8（CCK-8）相比以前的方法為細(xì)胞數(shù)測(cè)定和細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)提供了更方便和靈敏的方法。試劑盒使用了一種高水溶性的四唑鹽，WST-8，它在電子耦合試劑存在下還原產(chǎn)生水溶性formazan形式的染料。由脫氫酶產(chǎn)生的formazan的量與活細(xì)胞的數(shù)量呈直接的線性關(guān)系。CCK-8的檢測(cè)靈敏度高于其他方法，如MTT，XTT，MTS或WST-1等。
CCK-8法的優(yōu)勢(shì)
Features
比MTT，MTS或WST-1更敏感
對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性
步驟更簡(jiǎn)單，無(wú)需有機(jī)溶劑
穩(wěn)定的試劑，即用型
質(zhì)量控制
Protocol
1.簡(jiǎn)介
相比以前的方法如 MTT 檢測(cè)，Cell Counting Kit-8（CCK-8）為細(xì)胞數(shù)測(cè)定和細(xì)胞增殖/毒性測(cè)
定的研究提供了更方便和靈敏的方法。我們使用了一種高水溶性的四唑鹽，WST-8
[2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium,monosodiu
m salt]，它在電子耦合試劑存在下還原產(chǎn)生水溶性 formazan 形式的染料，如 Figure. 1 所示。
Figure.1 WST-8 和 WST-8 formazan 結(jié)構(gòu)
我們的產(chǎn)品 CCK-8 已經(jīng)與電子耦合試劑混合，是即用型。WST-8 可被活細(xì)胞中豐富的脫氫酶
還原，轉(zhuǎn)化為 formazan 形式，這是一種可溶于培養(yǎng)基的橙色染料（Figure. 2）。脫氫酶產(chǎn)生
的 formazan 的量與活細(xì)胞的數(shù)量呈直接的線性關(guān)系。
Figure.2 檢測(cè)原理
CCK-8 試劑盒為細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)中測(cè)定活細(xì)胞數(shù)提供了靈敏的比色檢測(cè)。以往的研
Protocol
究表明，CCK-8 的檢測(cè)靈敏度高于其他四唑鹽，如 MTT，XTT，MTS 或 WST-1。由于 WST-8
formazan 是水溶性的，因此不再需要添加 DMSO 等有機(jī)溶劑。WST-8 formazan 在 450nm 處
的吸光度與培養(yǎng)基中活細(xì)胞的數(shù)量呈線性關(guān)系，活細(xì)胞數(shù)可以使用對(duì)應(yīng)的吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)曲
線確定。CCK-8 檢測(cè)也可以代替[3H]-thymidine 摻入檢測(cè)。
2.需要的的設(shè)備和材料
酶標(biāo)儀 (450 nm 濾光片)
96 孔板
10 μl, 100-200 μl 多通道移液器
細(xì)胞 CO2培養(yǎng)箱
3.細(xì)胞活性檢測(cè)
3.1. 將細(xì)胞懸液（100 μl /孔）接種在 96 孔板中。在潮濕的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)一定時(shí)間（例如，
在 37℃，5％CO2下）。
3.2. 向板的每個(gè)孔中加入 10 μl CCK-8 溶液。 注意不要向孔中引入氣泡，因?yàn)樗鼈儠?huì)干擾
O.D. 值檢測(cè)。
3.3. 將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中孵育 1-4 小時(shí)。
3.4. 使用酶標(biāo)儀測(cè)量 450 nm 處的吸光度。
如果不立刻測(cè)量吸光度，可在每個(gè)孔中加入 10μl 1％w / v SDS 或 0.1 M HCl，蓋好并在室溫下
避光保存。24 小時(shí)內(nèi)不會(huì)觀察到吸光度變化。
4.細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)
4.1. 在 96 孔板中每孔接種 100 μl 細(xì)胞懸液（約 5000 個(gè)細(xì)胞/孔）。將板在潮濕的培養(yǎng)箱中預(yù)
培養(yǎng) 24 小時(shí)（例如，在 37℃，5％CO2下）。
4.2. 向孔中加入 10 μl 不同濃度的待測(cè)物質(zhì)。
4.3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間長(zhǎng)度（例如，6, 12, 24 或 48 小時(shí)）。
4.4. 向板的每個(gè)孔中加入 10 μl CCK-8 溶液。 注意不要向孔中引入氣泡，因?yàn)樗鼈儠?huì)干擾
O.D. 值檢測(cè)。
4.5. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育 1-4 小時(shí)。
4.6. 在讀取平板之前，可以在搖床上溫柔的混勻。然后使用酶標(biāo)儀測(cè)量 450 nm 處的吸光度。
如果不立刻測(cè)量吸光度，可在每個(gè)孔中加入 10μl 1％w / v SDS 或 0.1 M HCl，蓋好并在室溫下
避光保存。24 小時(shí)內(nèi)不會(huì)觀察到吸光度變化。
5.數(shù)據(jù)分析
統(tǒng)計(jì)分析有幾種方法，您可以選擇使用 O.D.值或細(xì)胞數(shù)量，我們提供其中一種方法。
細(xì)胞存活率（％）= [（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100
抑制率（％）= [（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100
As =實(shí)驗(yàn)孔吸光度（含有細(xì)胞，培養(yǎng)基，CCK-8 和待測(cè)化合物的孔的吸光度）
Ab =空白孔吸光度（含有培養(yǎng)基和 CCK-8 的孔的吸光度）
Ac =對(duì)照孔吸光度（含有細(xì)胞，培養(yǎng)基和 CCK-8 的孔的吸光度）
Protocol
6.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
6.1. 細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)
6.2. 使用培養(yǎng)基，等比稀釋細(xì)胞懸液為一個(gè)濃度梯度，通常需要 5-7 個(gè)濃度梯度，每組幾個(gè)
復(fù)孔。然后接種細(xì)胞。（注意每孔的細(xì)胞數(shù)量。如果您將細(xì)胞懸液稀釋在管中，在加入培養(yǎng)
板的孔之前，請(qǐng)小心再次混勻細(xì)胞。每孔中細(xì)胞懸液的體積應(yīng)該是一致的。）
6.3. 培養(yǎng)直至細(xì)胞貼壁（通常 2-4 小時(shí)），然后每 100 μL 培養(yǎng)基加入 10 μL CCK-8。繼續(xù)孵育
1-4 小時(shí)，用酶標(biāo)儀測(cè)量 450nm 處的吸光度。制作出一條以細(xì)胞數(shù)為 X 軸坐標(biāo)，O.D.值為 Y
軸坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
可以基于該曲線確定待測(cè)樣品的細(xì)胞數(shù)。使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的先決條件是培養(yǎng)檢測(cè)條件相同。
7.注意事項(xiàng)
7.1. 確保藥物和 CCK-8 均勻分布在培養(yǎng)基中。
7.2. 細(xì)胞增殖越多, 顏色越深; 細(xì)胞毒性越強(qiáng)，顏色越淺。
7.3. 對(duì)于貼壁細(xì)胞，每孔至少需要 1000 個(gè)細(xì)胞（100 μl 培養(yǎng)基）。對(duì)于白細(xì)胞，由于靈敏度
較低，每孔至少需要 2500 個(gè)細(xì)胞（100 μl 培養(yǎng)基）。推薦的 96 孔板每孔最大細(xì)胞數(shù)為 25000.
如果使用 24 孔或 6 孔板進(jìn)行該檢測(cè)，請(qǐng)計(jì)算相應(yīng)的每孔的細(xì)胞數(shù)，并調(diào)整 CCK-8 的體積，
使其為每孔總液體體積的 10％。
7.4. 因?yàn)?span> CCK-8 測(cè)定是基于活細(xì)胞中的脫氫酶活性，影響脫氫酶活性的條件或化學(xué)物質(zhì)可能
導(dǎo)致實(shí)際活細(xì)胞數(shù)與使用 CCK-8 測(cè)定活細(xì)胞數(shù)之間有差異。
7.5. WST-8 可能與還原劑反應(yīng)生成 WST-8 formazan。如果使用還原劑 (例如一些抗氧化劑)會(huì)
干擾檢測(cè)。如果待檢測(cè)體系中存在較多的還原劑，需設(shè)法去除。
7.6. 孵育 2 小時(shí)后，背景 O.D.值一般為 0.1-0.2 單位。
7.7. 注意不要在孔中引入氣泡，因?yàn)樗鼈儠?huì)干擾 O.D.值。
7.8. 如果您想對(duì) CCK-8 溶液進(jìn)行滅菌，請(qǐng)使用 0.2 μm 的膜過(guò)濾溶液。
7.9. 孵育時(shí)間因孔中細(xì)胞的類型和數(shù)量而異。通常，白細(xì)胞著色較弱，因此可能需要較長(zhǎng)的
孵育時(shí)間（長(zhǎng)達(dá) 4 小時(shí)）或大量細(xì)胞（~105細(xì)胞/孔）。
7.10. 如果細(xì)胞懸液中存在高濁度, 測(cè)量并減去樣品在 600nm 或更高波長(zhǎng)的 O.D 值。
7.11. CCK-8 不能用于細(xì)胞染色。
7.12. 培養(yǎng)基中的酚紅不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過(guò)扣除空白孔中
本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。
7.13. CCK-8的毒性非常低，在CCK-8測(cè)定完成后，相同的細(xì)胞可用于其他細(xì)胞增殖測(cè)定，例如
結(jié)晶紫測(cè)定，中性紅測(cè)定或DNA熒光測(cè)定。（除非細(xì)胞極為稀少，不推薦。）
7.14. 該試劑盒可用于大腸桿菌，但不能用于酵母細(xì)胞。
7.15. 在讀取平板之前，您可以在搖床上輕柔混勻。
7.16. 我們建議將細(xì)胞接種在靠近培養(yǎng)板中央的孔中，最外圍一圈孔中的培養(yǎng)基容易蒸發(fā)，
可以用PBS，水或培養(yǎng)基填充這些孔。
7.17. 如果您沒(méi)有 450 nm 濾光片。您也可以使用吸光度在 430 和 490 nm 之間的濾光片, 450
nm 濾光片具有最佳靈敏度。
7.18. 測(cè)量 450 nm 處的吸光度，如果您需要進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定，作為參考波長(zhǎng)可以測(cè)定 650 nm
處的吸光度。
7.19. 藥物中金屬離子的存在可能會(huì)影響 CCK-8 的靈敏度。終濃度為 1 mM 的氯化亞鉛、氯
化鐵、硫酸銅會(huì)抑制 5% 、15% 、90% 的顯色反應(yīng)，使靈敏度降低。如果終濃度是 10 mM
的話，將會(huì) 100% 抑制。
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